RAB35 es necesario para el desarrollo y las funciones del hipocampo murino regulando la distribución de células neuronales

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 440 (2023) Citar este artículo

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RAB35 es una pequeña GTPasa multifuncional que regula el reciclaje endocítico, el reordenamiento del citoesqueleto y la citocinesis. Sin embargo, sus funciones fisiológicas en el desarrollo de los mamíferos aún no están claras. Aquí, generamos ratones knockout para Rab35 y descubrimos que RAB35 es esencial para la embriogénesis temprana. Curiosamente, los ratones knockout para Rab35 específicos del cerebro mostraron defectos graves en la laminación del hipocampo debido a la distribución deficiente de las neuronas piramidales, aunque los defectos en la formación de la corteza cerebral no fueron evidentes. Además, los ratones knockout para Rab35 exhibieron defectos en la memoria espacial y comportamientos relacionados con la ansiedad. La proteómica cuantitativa indicó que la pérdida de RAB35 afectó significativamente los niveles de otras proteínas RAB asociadas con el tráfico endocítico, así como algunas moléculas de adhesión de células neurales, como la contactina-2. En conjunto, nuestros hallazgos revelaron que RAB35 es necesario para una distribución neuronal precisa en el hipocampo en desarrollo mediante la regulación de la expresión de moléculas de adhesión celular, influyendo así en la memoria espacial.

Las proteínas RAB forman la familia más grande de pequeñas GTPasas que regulan el tráfico de membrana intracelular en células eucariotas1. En particular, RAB35 es una proteína RAB altamente conservada en metazoos y está localizada en el endosoma de reciclaje y la membrana plasmática. RAB35 se descubrió originalmente como un regulador del reciclaje endocítico necesario para la citocinesis en las células HeLa2,3. En Caenorhabditis elegans, RAB35 controla el reciclaje endocítico de los receptores de la yema esenciales para el crecimiento de los ovocitos y la muerte celular4,5,6. Drosophila RAB35 funciona en la agrupación de actina, la fagocitosis, la liberación de neurotransmisores y la espermatogénesis7,8,9,10. En los mamíferos, RAB35 regula varias vías de tráfico de membranas, incluido el transporte retrógrado del endosoma al Golgi, la fagocitosis, la secreción de exosomas y la autofagia, además de su función principal en la vía de reciclaje8,11,12,13. El RAB35 de mamíferos también desempeña un papel en múltiples procesos celulares asociados con cambios dinámicos de la membrana, como la citocinesis, la formación de sinapsis inmunológica, la fusión de mioblastos, la longitud del cilio y la migración celular, en muchos tipos de células de cultivo y células primarias2,14,15,16. 17,18. Además, estudios previos en Drosophila y líneas celulares neuronales han informado sobre varias funciones de RAB35 en el sistema nervioso, incluido el crecimiento de neuritas, el alargamiento de axones, la secreción de exosomas, la liberación de neurotransmisores, la diferenciación de oligodendrocitos y el recambio de vesículas sinápticas9,11,19,20,21. 22. De hecho, recientemente han surgido asociaciones entre RAB35 y enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer23,24. Recientemente, RAB35 también ha sido identificado como un RAB oncogénico que promueve la proliferación celular25. Sin embargo, la importancia fisiológica de RAB35 en el desarrollo de los mamíferos sigue siendo en gran medida desconocida.

La formación del cerebro de los mamíferos es un proceso altamente orquestado que implica la generación, diferenciación, migración y maduración de neuronas. La migración neuronal es un proceso esencial para asegurar el posicionamiento adecuado de las neuronas y para la organización de estructuras multicapa, en particular la corteza cerebral y el hipocampo26. El deterioro de este proceso tiene un efecto adverso sobre las redes neuronales y la arquitectura cerebral, provocando varios trastornos neurológicos, como lisencefalia, epilepsia y esquizofrenia27,28,29. El mecanismo molecular asociado con la formación de estructuras laminadas se ha investigado principalmente en la corteza cerebral. Experimentos de derribo basados ​​en electroporación in utero han revelado que las proteínas RAB relacionadas con la endocitosis, como RAB5, RAB7, RAB11, RAB18 y RAB23, regulan la migración neuronal cortical en ratones controlando el tráfico de N-cadherina durante los distintos pasos de la endocitosis30. 31,32. Aunque se cree que el proceso de formación del hipocampo es similar, su mecanismo de desarrollo, incluido el papel de las proteínas RAB, no se comprende tan bien.

Para revelar la función fisiológica de RAB35 en mamíferos, aquí generamos ratones knockout para Rab35 sistémicos y descubrimos que RAB35 es esencial durante la embriogénesis temprana del ratón. También generamos ratones knockout para Rab35 específicos del sistema nervioso central (SNC) e identificamos a RAB35 como un requisito para el desarrollo adecuado del hipocampo. Nuestros hallazgos sugieren que RAB35 desempeña un papel esencial en el posicionamiento adecuado de las neuronas piramidales en el hipocampo al regular la expresión de las moléculas de adhesión de las células de la superficie, además de estar involucrado en la formación adecuada de la memoria espacial.

Para investigar la función fisiológica de RAB35 en el desarrollo de los mamíferos, generamos ratones knockout para Rab35 utilizando una línea de células ES (Figura complementaria 1a). La alteración del gen Rab35 se validó mediante transferencia Southern y PCR (Figura complementaria 1b, c). Los ratones objetivo heterocigotos (Rab35geo/+ o −/+) estaban sanos y fértiles. Para obtener los ratones knockout homocigotos (Rab35geo/geo y Rab35-/-), cruzamos los knockout heterocigotos y encontramos que ninguna descendencia era Rab35geo/geo o Rab35-/-, lo que indica que los ratones nulos Rab35 son embrionariamente letales. En el día embrionario (E) 15.5 y E11.5, no se obtuvieron embriones nulos Rab35. En E9.5, 9 (32%) embriones eran Rab35 +/+; 13 (46%) embriones eran Rab35-/+; y 6 (21%) embriones eran Rab35 -/- (Figura complementaria 1d). Estos resultados indican que Rab35 es esencial para el desarrollo temprano del ratón.

Estudios previos en Drosophila y líneas celulares neuronales han implicado que RAB35 desempeña un papel importante en diversas funciones neuronales, incluida la liberación de neurotransmisores, el alargamiento de neuritas, la diferenciación de oligodendrocitos y la secreción de exosomas9,11,15,20. Por tanto, nos centramos en la función in vivo de RAB35 en el desarrollo del cerebro. Para ello, primero determinamos los perfiles de expresión de RAB35 en el cerebro de ratón. Los niveles de proteína RAB35 aumentaron gradualmente desde E15 y alcanzaron su punto máximo en el día posnatal (P) 14 en el cerebro en desarrollo (Fig. 1a, b). Considerando todo el cerebro, la proteína RAB35 se expresó en el hipocampo en E15.5, y la expresión aumentó gradualmente durante el desarrollo (Fig. 1c, d). La tinción con LacZ detectó la expresión de RAB35 en varias subregiones del cerebro, incluida la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo en E15.5 (Fig. 1e). En el cerebro P1, la expresión fue más notable en el hipocampo y en una amplia zona de la corteza cerebral. Además, se identificó la expresión de RAB35 en el bulbo olfatorio y el cerebelo de cerebros de ratones adultos (Fig. 1f, g). Además, examinamos los tipos de células que expresan RAB35 en cerebros de ratones adultos mediante inmunotinción para β-galactosidasa utilizando el marcador neuronal maduro NeuN o la proteína ácida fibrilar glial marcadora de astrocitos (GFAP). Las imágenes de proyección de máxima intensidad revelaron puntos de β-galactosidasa en células NeuN positivas y GFAP positivas, lo que sugiere que RAB35 se expresa en neuronas y astrocitos (Fig. 1h, i).

a Niveles de proteína RAB35 en todo el cerebro del ratón durante los períodos embrionario (E15.5 y E17.5) y posnatal (P2, P6, P14 y P21). b Cuantificación de los niveles de proteína RAB35 en todo el cerebro del ratón. Las intensidades de las bandas de RAB35 se normalizaron frente a las de actina (n = 3 por la etapa indicada). c Niveles de proteína RAB35 en el hipocampo durante los períodos embrionario (E15.5 y E17.5) y posnatal (P2, P6, P14 y P21). d Cuantificación de los niveles de proteína RAB35 en el hipocampo del ratón (n = 3 por etapa). e Tinción con X-gal de secciones sagitales de cerebros de ratón E15 y P1 Rab35geo/+. Barras de escala, 200 μm. f Niveles de proteína RAB35 en subregiones del cerebro de ratones de 3 meses de edad. Bulbo olfatorio Ob, corteza cerebral Cx, hipocampo Hp, tálamo Th, cerebelo Cb. g Tinción con X-gal de una sección sagital de un cerebro de ratón Rab35geo/+ de 3 meses de edad. Barras de escala, 500 μm. h, i Imágenes representativas de proyección de intensidad máxima de cerebro de ratón Rab35geo/+ de 4 meses de edad teñido para β-galactosidasa (verde), NeuN o GFAP (magenta) y DAPI (azul). Barra de escala; panel superior, 50 µm; panel inferior, 20 µm. Los datos representan la media ± SEM.

Para investigar la importancia fisiológica de RAB35 en el desarrollo neuronal, generamos ratones knockout para Rab35 específicos del SNC cruzando ratones que albergan el alelo Rab35flox con ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor Nestin (Nestin-Cre)33 (Figura complementaria. 1a). Aunque la expresión de la proteína RAB35 fue detectable en el cerebro del ratón en E13.5 (Fig. 2a), fue indetectable en todo el cerebro de E13.5 Rab35flox/flox; Embriones Nestin-Cre y en la corteza cerebral y el hipocampo de Rab35flox/flox de 4 meses; Ratones Nestin-Cre (Fig. 2a, b). Los ratones knockout condicionales (cKO) Rab35 específicos del SNC nacieron con la frecuencia mendeliana y fueron viables durante más de 1 año. Los ratones Rab35 cKO machos y hembras mostraron gradualmente un peso corporal más bajo que el control Rab35flox/+; Ratones Nestin-Cre. (Figura complementaria 1e, f).

a, b Análisis de transferencia Western de E13.5 (a) y Rab35flox/flox, Rab35flox/+ de 4 meses (b); Nestin-Cre y Rab35flox/flox; Lisados ​​cerebrales de ratón Nestin-Cre. c – f Prueba de campo abierto en ratones control (n = 13) y Rab35 cKO (n = 17). c Huellas típicas de la actividad locomotora horizontal. d Distancia recorrida por minuto. ANOVA de dos vías de medidas repetidas; efecto de interacción, F(14, 392) = 1,094, p = 0,3612. e Distancia total recorrida. Prueba de Mann-Whitney, p = 0,3. f Estancia de tiempo en la zona central. Prueba U de Mann-Whitney, p < 0,001. g – j Laberinto plus elevado en ratones control (n = 20) y Rab35 cKO (n = 22). g Porcentaje acumulado de ratones que caen de los brazos abiertos. h Trazas típicas en la prueba del laberinto elevado en cruz. Quédate el tiempo con los brazos abiertos. Prueba t de Student no apareada, p = 0,0054. j Quédate tiempo en los brazos cerrados. Prueba U de Mann-Whitney, p = 0,0034. Prueba k Rotarod en ratones control (n = 23) y Rab35 cKO (n = 20). ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección de Bonferroni; efecto de interacción, F(5, 205) = 3,009, p = 0,0121; ensayo 3, p = 0,0076; ensayo 4, p < 0,0001; ensayo 5, p = 0,0059; ensayo 6, p = 0,0008. Pruebas de laberinto l, m Barnes en ratones control (n = 16) y Rab35 cKO (n = 19). l Latencia para llegar al hoyo objetivo. Cada punto representa la media de tres ensayos. ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección de Bonferroni; efecto de interacción, F(3, 99) = 1,706, p = 0,1706; día 1, p = 0,0261; día 4, p = 0,0030. m Tiempo transcurrido alrededor del agujero objetivo durante un período de 90 s. Prueba U de Mann-Whitney, p = 0,0136. n Porcentajes de alternancia en la prueba del laberinto Y de ratones control (n = 15) y Rab35 cKO (n = 18). Prueba t de Student no apareada, p = 0,01454. Los datos representan media ± SEM o diagramas de caja y bigotes; el diagrama de caja muestra los percentiles 25 y 75 (cuadro), la mediana (barra horizontal) y el mínimo al máximo (bigotes); ns no significativo (p > 0,05); *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; y ****p < 0,0001.

Para evaluar el impacto de la deficiencia de RAB35 en el comportamiento del ratón, realizamos pruebas de comportamiento. En la prueba de campo abierto, que mide la actividad motora espontánea y el comportamiento relacionado con la ansiedad en un entorno nuevo, los ratones Rab35 cKO exhibieron movimientos espontáneos con tiempos de viaje similares a los de los ratones de control (Fig. 2c-e), lo que indica que sus actividades locomotoras horizontales fueron comparable. Mientras tanto, el tiempo pasado en el centro del aparato de campo abierto aumentó significativamente en ratones Rab35 cKO (Fig. 2c, f). Luego realizamos la prueba del laberinto elevado en cruz para evaluar las conductas relacionadas con la ansiedad. Aunque 13 de los 22 ratones Rab35 cKO cayeron de los brazos abiertos durante la prueba (Fig. 2g), evaluamos los niveles de ansiedad de nueve ratones que completaron la prueba sin caerse. Los ratones Rab35 cKO pasaron significativamente más tiempo en los brazos abiertos y menos tiempo en los brazos cerrados que los ratones de control (Fig. 2h-j). Estos resultados indicaron que los ratones Rab35 cKO exhiben una reducción de los comportamientos relacionados con la ansiedad.

En la prueba acelerada de rotarod, que se utiliza para evaluar la función motora, los ratones de control aumentaron el tiempo que pasaban en la varilla giratoria después de varias pruebas, y la mayoría de los ratones de control finalmente pasaron más de 150 s en una varilla. Por el contrario, los ratones Rab35 cKO mostraron una latencia de caída significativamente reducida (Fig. 2k). En conjunto, estos resultados sugieren que la deficiencia de RAB35 no afecta la actividad locomotora horizontal, pero causa defectos en las conductas relacionadas con la ansiedad y la función motora.

Además, evaluamos el aprendizaje espacial y la memoria mediante la prueba del laberinto de Barnes (Fig. 2l, m). El laberinto de Barnes consta de una mesa circular con 16 hoyos alrededor del perímetro y señales visuales alrededor de la mesa. De los 16 hoyos, sólo uno contiene una caja de escape debajo, considerada el objetivo. Esta prueba consta de varias fases, incluida la fase de adquisición y la prueba de sonda. Durante la fase de adquisición, se evaluó la capacidad de aprendizaje espacial de cada ratón midiendo el tiempo necesario para alcanzar el objetivo. Como se esperaba, los ratones de control aprendieron la ubicación del orificio objetivo para evitar la iluminación brillante de la habitación, y se requirió un tiempo reducido para alcanzar el objetivo en cada prueba. Los ratones Rab35 cKO tardaron significativamente más tiempo en alcanzar el objetivo que los ratones de control el día 4 (Fig. 2l). La prueba de sonda se realizó un día después de la última prueba de adquisición para examinar la adquisición de la memoria espacial. Quitamos la caja de escape de la mesa y medimos el tiempo pasado en la proximidad del objetivo para determinar si los ratones habían memorizado la posición del orificio del objetivo. Como se muestra en la Fig. 2m, los ratones Rab35 cKO pasaron un tiempo ligeramente pero significativamente menor alrededor del orificio objetivo correcto que los ratones de control. Para analizar los efectos potenciales de RAB35 en la memoria a corto plazo, se examinó a ratones en una prueba de laberinto en Y. El porcentaje de alternancia espontánea en ratones Rab35 cKO fue comparable al de los ratones control (Fig. 2n). Estos resultados sugieren que los ratones Rab35 cKO presentan déficits en la memoria espacial pero no en la memoria de trabajo.

A continuación, investigamos si la pérdida de RAB35 afecta la arquitectura del cerebro. La corteza cerebral de los mamíferos tiene una estructura de seis capas. Durante el desarrollo cortical, las neuronas excitadoras se generan a partir de células gliales radiales en el lado ventricular34,35. Las neuronas recién nacidas migran radialmente desde el lado ventricular apical hacia la superficie pial basal y dejan de migrar justo debajo de la zona marginal. Por tanto, las neuronas tempranas forman la capa profunda (capas VI y V), mientras que las neuronas tardías atraviesan la capa profunda y se asientan en capas más superficiales (capas IV-II); por lo tanto, la estructura adecuada de seis capas de la corteza cerebral se forma de adentro hacia afuera y depende de la fecha de nacimiento36,37. Las neuronas corticales se segregan en capas celulares con neuronas formadas aproximadamente en el mismo período y que expresan factores de transcripción específicos de cada capa, incluidas las proteínas 2 que interactúan con el factor de transcripción promotor de ovoalbúmina de pollo (Ctip2; un marcador de la capa V) y la homeobox cortada 1 (Cux1; un marcador para la capa II-IV), para diferenciar y establecer conexiones neuronales dependientes de la capa.

La vista dorsal o el peso del cerebro de los ratones Rab35 cKO fue comparable al de los ratones de control (Fig. 3a, b). En ratones Rab35 cKO, el grosor de la corteza cerebral y el grosor relativo de la capa superficial positiva para Cux1 (capas II-IV), así como el de la capa profunda positiva para Ctip2 (capa V), fueron comparables con los de controle los ratones en P0, el período en el que la mayoría de las neuronas excitadoras corticales alcanzan su capa (Fig. 3c-f). Evaluamos más a fondo la migración neuronal en la corteza cerebral utilizando el análisis de la fecha de nacimiento del etiquetado con 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) (Fig. 3g, h). Se inyectó EdU por vía intraperitoneal en ratones preñados en E14.5 y los cerebros de las crías se recogieron en P12. La corteza cerebral se dividió en 10 contenedores iguales desde las superficies ventricular hasta pial, y se cuantificó la proporción de células EdU positivas en cada contenedor. Las neuronas corticales con deficiencia de RAB35 marcadas con EdU no mostraron defectos de migración significativos. La inmunotinción para NeuN no reveló diferencias significativas en la distribución de células positivas para NeuN entre las cortezas de los ratones adultos control y Rab35 cKO (Fig. 3i). También se demostró que el grosor de la corteza cerebral y la cantidad de células NeuN positivas en las cortezas de 300 μm de ancho se mantienen en ratones Rab35 cKO (Fig. 3j, k). Por tanto, estos resultados indican que la arquitectura laminada se conserva en la corteza cerebral de ratones con deficiencia de RAB35.

Una vista dorsal de los cerebros de ratones control y Rab35 cKO de 3 meses de edad. Barra de escala, 2 mm. b Pesos del cerebro de ratones machos control (n = 7) y Rab35 cKO (n = 8) de 3 meses de edad. Prueba U de Mann-Whitney, p = 0,8409. c Imágenes representativas de las cortezas P0 de los ratones control y Rab35 cKO inmunoteñidos para Cux1 (magenta), Ctip2 (verde) y DAPI (azul). Barra de escala, 100 μm. d – f Cuantificación de los espesores de capa cortical (d), relativa Cux1 positiva (e) y Ctip2 positiva (f) de ratones control P0 (n = 4) y Rab35 cKO (n = 4). Los espesores de las capas positivas para Cux1 y Ctip2 se midieron y normalizaron con respecto al espesor cortical total. prueba U de Mann-Whitney; d, p = 0,6857; e,p>0,99; f, p = 0,2. g Imágenes representativas del análisis de la fecha de nacimiento del etiquetado de EdU de muestras de corteza P12 teñidas con EdU (magenta) y DAPI (azul). Barra de escala, 100 μm. h Proporción de neuronas positivas para EdU en las cortezas P12 de ratones control (n = 4) y Rab35 cKO (n = 4). ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección de Bonferroni; efecto de interacción, F(9, 54) = 0,4991, p = 0,8687. i Inmunohistoquímica de secciones sagitales de cortezas cerebrales de ratones control y Rab35 cKO de 4 meses de edad utilizando un anticuerpo anti-NeuN. Barras de escala, 100 μm. j, k Análisis cuantitativo del grosor cortical (j) y el número de células NeuN positivas en la corteza cerebral de 300 μm de ancho (k) de los ratones control (n = 5) y Rab35 cKO (n = 5). Prueba t de Student no apareada; j, p = 0,6928; k, p = 0,5375. Los datos representan media ± SEM o diagramas de caja y bigotes; el diagrama de caja muestra los percentiles 25 y 75 (cuadro), la mediana (barra horizontal) y el mínimo al máximo (bigotes); ns, no significativo (p > 0,05).

A diferencia de la corteza cerebral, encontramos que la estructura laminada del hipocampo estaba gravemente desorganizada en ratones Rab35 cKO (Fig. 4a). El hipocampo contiene una capa de células piramidales muy compacta, también llamada estrato piramidal (SP), del cuerno de Amón (regiones CA1, CA2 y CA3) y una capa de células granulares (GCL) de la circunvolución dentada (DG), como se muestra en la figura. controlar ratones. Sin embargo, en el hipocampo Rab35 cKO, el SP en CA1 se fracturó notablemente en estrato oriens (SO), y las células piramidales en CA3 se distribuyeron más extensamente. Se observaron neuronas piramidales ectópicas en la región CA1 del hipocampo ventral (Figura complementaria 2a). Según el análisis cuantitativo de bin, los ratones Rab35 cKO mostraron cambios significativos en la distribución de las células piramidales en CA1 y CA3 (Fig. 4b, c). El número de neuronas positivas para NeuN en las regiones CA1 o CA3 deficientes en RAB35 fue comparable a las de los controles (Figuras complementarias 2b, c). Además, las células granulares en el DG se dispersaron hacia la capa molecular con un mayor número de células en ratones Rab35 cKO (Fig. 4d y Fig. Suplementaria 2d). Las neuronas CA1 positivas para Ctip2, utilizadas aquí como marcador neuronal posmitótico, presentaron una capa de células dividida en P6, el período en el que la mayoría de las neuronas excitadoras del hipocampo recién nacidas llegan a su posición final (Figura complementaria 2e), lo que sugiere que las neuronas del hipocampo se posicionan ectópicamente. durante la etapa de desarrollo.

a Inmunohistoquímica de secciones sagitales de hipocampos de ratones control y Rab35 cKO de 4 meses de edad utilizando un anticuerpo anti-NeuN. SP: estrato piramidal, SO: estrato oriens. Barras de escala, 200μm. b – d Distribución de células NeuN positivas en las regiones de control (n = 4) y Rab35 cKO (n = 4) del hipocampo CA1 (b), CA3 (c) y DG (d). ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección de Bonferroni; b efecto de interacción, F(4, 32) = 4,161, p = 0,008; c efecto de interacción, F(4, 32) = 3,264, p = 0,0236; d efecto de interacción, F(4, 32) = 25,9, p < 0,0001. e Imágenes representativas de hipocampos P12 teñidas con EdU (magenta) y DAPI (azul). Barra de escala, 100 μm. f Proporción de neuronas positivas para EdU en los hipocampos P12 de ratones control (n = 4) y Rab35 cKO (n = 4). ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección de Bonferroni; efecto de interacción, F(4, 24) = 3,712, p = 0,0173. g Imágenes representativas de neuronas primarias del hipocampo DIV 3 teñidas para p-NF (verde) con rodamina-faloidina (magenta) y DAPI (azul). Barra de escala, 100 μm. h, i Cuantificación de la longitud total de las neuritas positivas para rodamina-faloidina (h) y la longitud del axón positivo para p-NF (i) de las neuronas primarias de control y deficientes en Rab35 en DIV 3. Al menos 50 neuronas de cuatro (control) y se midieron tres cultivos diferentes (Rab35 cKO). Prueba t de Student no apareada; h, p = 0,8204; yo, p = 0,8832. j Imágenes representativas de la comisura ventral del hipocampo (VHC) de ratones control de 3 meses y Rab35 cKO (bregma −0,35 mm) mediante tinción de Klüver-Barrera. Barra de escala, 200 μm. k Espesor de VHC en ratones control (n = 6) y Rab35 cKO (n = 7). Prueba t de Student no apareada, p = 0,0695. Los datos representan la media ± SEM; ns no significativo (p > 0,05); *p < 0,05; **p < 0,01; y ***p < 0,001.

Dado que las neuronas piramidales del hipocampo de roedores en las regiones CA1-CA3 se generan a partir de un neuroepitelio compartido dorsalmente con la neocorteza, se considera que las estructuras laminadas en las regiones CA del hipocampo forman patrones similares a los de la corteza cerebral27,38. Durante el desarrollo de la corteza cerebral y el hipocampo, se generan neuronas excitadoras a partir de dos tipos principales de células progenitoras: células gliales radiales en la zona ventricular (VZ) y progenitoras intermedias en la zona subventricular (SVZ)34,35. Las células gliales radiales producen progenitores o neuronas intermedias en la VZ mediante división asimétrica, mientras que los progenitores intermedios migran y se acumulan en la zona subventricular (SVZ) justo por encima de la VZ. La formación de estructuras laminadas en el hipocampo depende principalmente de la producción y migración altamente coordinadas de neuronas desde las zonas proliferativas. El control espaciotemporal de la proliferación de células progenitoras neurales es importante para la producción y posicionamiento de las neuronas. Además del potencial proliferativo, la morfología de las células gliales radiales también juega un papel importante en las posiciones neuronales porque las neuronas recién nacidas utilizan procesos radiales como andamios para migrar hacia la posición final en el SP primitivo.

Luego investigamos la integridad funcional y morfológica de los progenitores neurales en el hipocampo Rab35 cKO. Las distribuciones de las células gliales radiales positivas para la proteína de caja pareada 6 (Pax6) y los progenitores intermedios positivos para la proteína cerebral 2 de caja T (Tbr2) fueron similares en las regiones control y Rab35 cKO CA en E15.5 (Figura complementaria 2f, gramo). El número de ambos progenitores fue comparable en ratones control y Rab35 cKO (Figura complementaria 2h, i). La inmunotinción para histona fosforilada H3 (pHH3), un marcador de células en mitosis, mostró que el número de células positivas para pHH3 en la región Rab35 cKO CA no cambió significativamente en comparación con los ratones de control (Figura complementaria 2j, k). Se obtuvieron resultados similares en DG (Figuras complementarias 2l-n). Estos resultados indican que la eliminación condicional de Rab35 utilizando ratones transgénicos Nestin-Cre no afecta el patrón espacial ni la potencia de proliferación de los progenitores neuronales en el hipocampo. Además, realizamos inmunotinción utilizando un anticuerpo para Nestin, una proteína de filamento intermedio en las células gliales radiales, para observar la morfología de los procesos radiales. Los procesos gliales radiales positivos para Nestina parecían estar organizados normalmente en las secciones sagitales del hipocampo E15.5 Rab35 cKO (Figura complementaria 2o). A partir de estos datos, la función y la forma de las células progenitoras neurales del hipocampo se mantienen en ratones Rab35 cKO.

Dado que la pérdida de RAB35 no afectó a las células progenitoras neurales, examinamos si la malformación de la capa del hipocampo podría atribuirse a una migración o posicionamiento defectuoso de las neuronas durante el desarrollo utilizando el análisis de fecha de nacimiento del etiquetado EdU (Fig. 4e, f). La región CA1 del hipocampo, desde el borde de la superficie apical hasta 400 μm, se dividió en cinco contenedores iguales y se cuantificó la proporción de células EdU positivas en cada contenedor. En ratones de control, más del 90% de las neuronas EdU positivas alcanzaron los contenedores 2 y 3, mientras que, en ratones Rab35 cKO, la proporción de neuronas EdU positivas en los contenedores 2 y 3 disminuyó con un aumento en los contenedores 1 y 4 (Fig. 4f ), lo que sugiere que las células neuronales podrían migrar, pero no se distribuyeron en la ubicación precisa. Estos hallazgos indican que se requiere RAB35 para la distribución precisa de las células piramidales en el hipocampo en desarrollo.

Con base en estudios previos de que la eliminación de RAB35 suprime el alargamiento de las neuritas en células PC12 y axones en neuronas primarias del hipocampo de rata y que la sobreexpresión de RAB35 de tipo salvaje o mutante constitutivamente activo mejora el alargamiento, examinamos la neuritogénesis en neuronas primarias extraídas de ratones Rab35 cKO. . Las neuronas primarias del hipocampo cultivadas durante días in vitro (DIV) 3 se sometieron a inmunotinción para una cadena pesada de neurofilamento fosforilado marcador de axón (pNF-H) y rodamina-faloidina (Fig. 4g). Las longitudes tanto de la neurita total positiva para faloidina como del axón positivo para pNF-H en neuronas primarias deficientes en RAB35 fueron comparables con las de las neuronas de control (Fig. 4h, i), lo que indica que las neuronas primarias derivadas del hipocampo cKO Rab35 sostienen suficiente potencial para la neuritogénesis. Para evaluar el papel de RAB35 en el alargamiento del axón in vivo, examinamos el grosor de la comisura ventral del hipocampo (VHC) (Fig. 4j, k). Los ratones Rab35 cKO tendieron a exhibir un espesor de VHC relativamente reducido en comparación con el de los ratones de control; Sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Estos hallazgos sugieren que la neuritogénesis no está marcadamente alterada a pesar de la ausencia de RAB35.

Para comprender mejor el mecanismo molecular por el cual RAB35 contribuye a la migración neuronal, evaluamos la expresión diferencial de proteínas en el hipocampo de P0 en ratones control y Rab35 cKO utilizando un etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem (TMT) multiplexada y análisis LC-MS/MS. . En el hipocampo P0, la neurogénesis alcanzó su punto máximo y la mayoría de las neuronas piramidales migraron hacia su posición. Entre las 7495 proteínas identificadas y cuantificadas utilizando la proteómica del hipocampo P0, 193 estaban reguladas hacia arriba o hacia abajo significativamente cuando el umbral se estableció en p <0,01 (Fig. 5a y Datos complementarios 1). De acuerdo con el análisis de transferencia Western (Fig. 2a, b), confirmamos que la proteína RAB35 disminuyó notablemente. Este conjunto de datos incluyó 37 proteínas relacionadas con el tráfico de membrana, especialmente las vías endocíticas y de reciclaje, y 35 de 37 proteínas, incluidas RAB11B, RAB4A, Snx3, Atg9a, Vamp4 y RAB7, disminuyeron en el hipocampo Rab35 cKO (Fig. 5b y Tabla complementaria 1), lo que sugiere que la pérdida de RAB35 podría alterar las vías de reciclaje y endocíticas.

un gráfico de volcán de los proteomas cuantitativos basados ​​en TMT que identifican las proteínas desreguladas en el hipocampo Rab35 cKO en comparación con el hipocampo de control (n = 5 ratones por genotipo). b Número de proteínas identificadas como significativamente desreguladas y relacionadas con el tráfico de membrana o con la migración neuronal. c, d Análisis de transferencia Western de hipocampos control y Rab35 cKO P0 utilizando anticuerpos anti-contactina-2, anti-CHL1 y anti-actina. e, f Cuantificación de los niveles de proteína contactina-2 (c) y CHL1 (d) en hipocampos control y Rab35 cKO P0. Las intensidades de las bandas de las proteínas indicadas se normalizaron con respecto a las de actina (n = 9 ratones por genotipo). Prueba t de Student no apareada; mi, p = 0,0153; f, p = 0,0095. g, h Los niveles de contactina-2 (g) y CHL1 (h) se cuantificaron mediante MS dirigida utilizando el método PRM (n = 5 ratones por genotipo). Prueba t de Student no apareada; gp = 0,0053; CV = 0,0229. i Análisis de transferencia Western del hipocampo control y Rab35 cKO P0 utilizando anticuerpos anti-N-cadherina y anti-actina. j Cuantificación de los niveles de proteína N-cadherina en el hipocampo control y Rab35 cKO P0 (n = 9 ratones por genotipos). Prueba t de Student no apareada, p = 0,9020. k Imágenes representativas de neuronas primarias del hipocampo DIV 2 teñidas para contactina-2 (verde), rodamina-faloidina (magenta) y DAPI (azul). Barra de escala, 20 μm. l Cuantificación de la intensidad de contactina-2 en la membrana plasmática somática en células de control (n = 4) y con deficiencia de Rab35 (n = 4). Se analizaron treinta neuronas de cuatro cultivos diferentes por genotipo. Prueba U de Mann-Whitney, p = 0,0286. Los datos representan la media ± SEM; ns no significativo (p > 0,05); *p < 0,05; **p<0,01.

En el conjunto de datos, encontramos que 25 proteínas relacionadas con la migración neuronal se ven afectadas por la pérdida de RAB35. Entre estos, la contactina-2/expresó transitoriamente la glicoproteína-1 de la superficie axonal (TAG-1) y el homólogo cercano de L1 (CHL1) fue significativamente más abundante en el hipocampo Rab35 cKO que en los ratones control (Fig. 5a y Tabla complementaria 2). . La contactina-2 y CHL1 son moléculas de adhesión de células neurales (NCAM) de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) que pertenecen a las subfamilias de contactina y L1, respectivamente. La contactina-2 y CHL1 están presentes en la superficie celular y median las adhesiones célula-célula y sustrato celular a través de interacciones homofílicas y/o heterófilas con otras moléculas de adhesión celular y la matriz extracelular para desempeñar un papel en el crecimiento de los axones y en la guía de las neuronas migratorias. en el cerebro en desarrollo. Confirmamos que los niveles de proteína tanto de contactina-2 como de CHL1 aumentaron significativamente en el hipocampo P0 Rab35 cKO mediante análisis de transferencia Western y espectrometría de masas dirigida basada en monitoreo de reacciones paralelas (PRM) (Fig. 5c-h). Los niveles de proteína de otras moléculas de adhesión celular, incluida la N-cadherina de la familia de cadherinas, se mantuvieron sin cambios en los ratones control y Rab35 KO (Fig. 5i, j). En las neuronas del hipocampo DIV 2 aisladas de embriones E18, se demostró que la contactina-2 estaba localizada en la membrana plasmática del soma y las neuritas (Fig. 5k). Además, la intensidad de fluorescencia de la contactina-2 en la membrana plasmática somática de las neuronas con deficiencia de RAB35 fue significativamente mayor en comparación con las neuronas de control (Fig. 5l). GFP-RAB35 expresado exógenamente tendió a reducir el nivel de la señal de contactina-2 en la membrana plasmática somática en comparación con la de las células de control; sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura complementaria 2p). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la ablación de RAB35 afecta la homeostasis de las proteínas en el hipocampo en desarrollo, lo que resulta en un aumento de los niveles de contactina-2 y CHL1, probablemente debido a un defecto en la internalización desde la superficie celular y/o el reciclaje de regreso a la membrana plasmática.

RAB35 juega un papel importante en diversos procesos celulares asociados con cambios dinámicos de membrana, como el reciclaje endocítico, la citocinesis, la migración celular y el crecimiento de neuritas. Sin embargo, la función fisiológica del RAB35 de los mamíferos aún no se ha investigado. Este estudio, en el que participaron ratones knockout para Rab35 sistémicos y específicos del SNC, identificó a RAB35 como un componente esencial en el desarrollo del hipocampo al regular adecuadamente el posicionamiento neuronal.

La eliminación sistémica de Rab35 causó letalidad embrionaria hasta E11.5, lo que indica que RAB35 es esencial para el desarrollo embrionario. Se obtuvieron embriones knockout homocigotos para Rab35 en E9.5, con la frecuencia mendeliana esperada (Figura 1 complementaria), lo que sugiere que se implantaron embriones knockout para Rab35 pero no se desarrollaron. Después de la implantación, la gastrulación forma capas esenciales, incluidos el ectodermo, el mesodermo y el endodermo. Las células del endodermo visceral exhiben una alta actividad endocítica, suministran nutrientes maternos y controlan las cascadas de señalización para el crecimiento embrionario. Curiosamente, la deficiencia de RAB7 perturba el flujo endocítico en las células del endodermo visceral y causa niveles reducidos de aminoácidos intracelulares, junto con una señalización celular desregulada, lo que resulta en un fenotipo embrionario letal en E739,40. Una posible explicación de la naturaleza esencial de RAB35 durante el desarrollo es que los embriones knockout para Rab35 presentan defectos en las vías de reciclaje en el endodermo visceral. Se requieren investigaciones adicionales para establecer el papel de RAB35 en la embriogénesis del ratón. Además, también generamos ratones Rab35 cKO específicos del SNC para examinar el papel de RAB35 en el desarrollo del cerebro. Los ratones Rab35 cKO específicos del SNC tenían pesos cerebrales comparables a los de los ratones de control y conservaron la estructura laminada de la corteza cerebral (Fig. 3). Aunque RAB35 participa en la neuritogénesis, las neuronas de ratones Rab35 cKO mostraron axones alargados in vitro e in vivo (Fig. 4). Esta discrepancia puede surgir debido a diferencias en las líneas celulares/tejidos utilizados o diferencias entre el agotamiento crónico y agudo de RAB35. Alternativamente, otras proteínas RAB pueden compensar los defectos causados ​​por la pérdida de RAB35 durante el desarrollo temprano del cerebro.

Por el contrario, los hipocampos con deficiencia de RAB35 mostraron una capa celular desorganizada a través de las regiones CA y DG (Fig. 4). La laminación del hipocampo se forma bajo el estricto control espaciotemporal de la producción neuronal y la migración de neuronas desde las zonas proliferativas. El potencial proliferativo y la morfología de las células gliales radiales fueron normales en ratones Rab35 cKO (Figura complementaria 2). Estos hallazgos indican que ni la proliferación neuronal defectuosa de las células gliales radiales ni los procesos radiales utilizados como andamio para las neuronas migratorias son las causas principales del mal posicionamiento de las neuronas mutantes. En el análisis de la fecha de nacimiento, las neuronas Rab35 cKO migraron pero no lograron migrar a ubicaciones precisas. Estos datos indican que se requiere RAB35 para distribuir con precisión las células piramidales en el hipocampo en desarrollo.

Aunque se ha informado que varias proteínas RAB asociadas con la endocitosis (RAB5, 7, 11, 18, 23) desempeñan funciones importantes en la formación de la estructura de seis capas en la corteza cerebral al regular distintos pasos de la migración neuronal30,31,32, Aún se desconoce la participación de estas proteínas RAB en la laminación del hipocampo. Curiosamente, los ratones con deficiencia de RAB35 mostraron una estructura de corteza cerebral superficialmente normal pero exhibieron una laminación hipocámpica defectuosa, lo que sugiere que RAB35 contribuye más predominantemente al posicionamiento neuronal adecuado en el hipocampo que en la corteza cerebral.

¿Cómo perturba ampliamente la pérdida de RAB35 el tráfico de membranas en las neuronas del hipocampo? Una posible explicación es que la pérdida de RAB35 altera la homeostasis de la fosfoinositida (PI) y conduce a defectos en el tráfico endocítico. Se sabe que RAB35 regula la homeostasis de los PI, especialmente PtdIns(4,5)P2 y PtdIns3P/PtdIns(3,5)P2, en coordinación con sus efectores, ACAP2 y miotubularina fosfatasas, respectivamente. ACAP2 es una proteína activadora de GTPasa (GAP) para Arf6, que activa su efector PIP5K para sintetizar PtdIns (4,5) P2. El RAB35 activado se localiza en los compartimentos positivos para Arf6 y luego recluta a ACAP2 para inactivar Arf6 y terminar la síntesis de PtdIns(4,5)P23,41,42. Por el contrario, estudios recientes han informado que RAB35 controla el recambio de PtdIns3P y PtdIns(3,5)P2 mediante la unión a complejos de lípido fosfatasa que contienen proteína 13 relacionada con miotubularina y MTMR2, que hidrolizan el 3-fosfato de PtdIns3P y PtdIns( 3,5)P2 ubicado en los endosomas. Por tanto, la falta de RAB35 podría provocar un aumento local de PtdIns(4,5)P2, PtdIns3P y PtdIns(3,5)P2, perturbando así las vías de reciclaje y endocíticas. De hecho, los resultados del análisis proteómico revelaron que los niveles de varios reguladores endocíticos, como Snx3 y Snx27, los cuales se unen a PtdIns3P y PIP5k1c, se redujeron significativamente en los lisados ​​​​de hipocampo deficientes en RAB35 (Fig. 5 y Tabla complementaria 1). .

También encontramos que las proteínas de la superficie celular IgSF, a saber, contactina-2 y CHL1, aumentaron en el hipocampo Rab35 cKO en desarrollo. Se ha informado que CHL1 desempeña un papel en la migración neuronal en el cerebelo y la corteza cerebral caudal43,44,45. Durante el desarrollo del cerebelo, la proteína CHL1 de la familia L1 controla la migración neuronal mediante interacciones trans heterófilas de CHL1 con vitronectina e integrinas. Además, las regiones citoplasmáticas de CHL1 interactuaron con ezrin y ankyrin para participar en la dinámica de la actina46,47. El aumento o disminución del nivel de otra proteína de la familia L1 retrasó la migración de las neuronas corticales48,49. También se ha informado que la contactina-2 está involucrada en la migración de interneuronas corticales y neuronas de la médula caudal50,51. Contactin-2 se unió a L1 mediante interacción cis y permitió a L1 reclutar Ankyrin52. Dado que RAB35 es necesario para la endocitosis y el reciclaje de proteínas de la superficie celular, la pérdida de RAB35 podría alterar el reciclaje y el direccionamiento de estas moléculas a los lugares apropiados para la migración neuronal, lo que resultaría en la distribución desordenada de las neuronas piramidales y las células granulares en el hipocampo. . Además, la deficiencia de RAB35 puede afectar la dinámica de la actina intracelular. Alternativamente, la pérdida de RAB35 puede causar una acumulación local aberrante de derivados de PI en los compartimentos de la membrana, perturbando así el tráfico endocítico de proteínas de la superficie celular.

Las pruebas de comportamiento revelaron que los ratones Rab35 cKO específicos del SNC tienen defectos en una amplia gama de comportamientos, como los relacionados con la ansiedad y la función motora, así como en la memoria espacial. (Figura 2). El hipocampo dorsal es responsable del aprendizaje espacial y la memoria, mientras que el hipocampo ventral funciona como parte del circuito de ansiedad. Por lo tanto, el rendimiento reducido de la memoria espacial en ratones Rab35 cKO podría estar asociado con una laminación desorganizada del hipocampo. Varias regiones del cerebro, incluidas la amígdala, el cuerpo estriado, el hipocampo ventral y la corteza prefrontal, modulan las conductas relacionadas con la ansiedad. Nuestros datos sugieren que la formación alterada de capas en el hipocampo ventral de ratones Rab35 cKO puede afectar comportamientos similares a la ansiedad. Dado que RAB35 también se expresa en otras regiones del cerebro, incluido el cuerpo estriado y la corteza prefrontal, la pérdida de RAB35 en dichas regiones puede contribuir a reducir los comportamientos relacionados con la ansiedad en ratones Rab35 cKO. Por lo tanto, se necesitan más estudios para comprender las funciones fisiológicas de RAB35 en el desarrollo y la función del cerebro.

Estudios recientes han sugerido asociaciones entre RAB35 y enfermedades neurodegenerativas. Nuestros datos proteómicos mostraron una disminución significativa en los factores LRP1 y presenilina relacionados con la enfermedad de Alzheimer en el hipocampo con deficiencia de RAB35. Una mayor caracterización de las funciones fisiológicas y patológicas de RAB35 proporcionará una mejor comprensión de la patología molecular de las enfermedades neurodegenerativas.

Se generaron ratones knockout para Rab35 como se describió anteriormente53. Los clones ES knockout para Rab35 se adquirieron de EUCOMM, con la secuencia SA-IRES-βgeo-polyA insertada en el segundo intrón del gen Rab35. Los clones ES objetivo se identificaron mediante análisis de transferencia Southern y se inyectaron en los embriones BALB/c para generar los ratones Rab35geo/+. Los ratones fueron retrocruzados durante más de seis generaciones con el fondo C57BL/6. Para generar los ratones Rab35flox/+ y Rab35−/+, los ratones Rab35geo/+ se cruzaron con ratones transgénicos Act-Flp-e y CAG-Cre (Jackson Laboratory), respectivamente. Para generar ratones knockout para Rab35 específicos del SNC, se cruzaron ratones Rab35flox/+ con ratones transgénicos Nestin-Cre33. Los genotipos de cada línea de ratón se confirmaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: cebador 1 (brazo 5'), 5′-ACACTTCACATGGCTCTGGTCCC-3'; cebador 2 (brazo 3 '), 5′-CTTCAGCAGACCCACAATGCGAGC-3'; cebador 3 (LAR3), 5′-CAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC-3'; y cebador 4 (40 R), 5′-TGAACTGATGGCGAGCTCAGACC-3'. El gen cre se identificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: directo, 5′-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3'; y reverso, 5′-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3′. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las pautas del Comité de Experimentación y Cuidado de Animales de la Universidad de Gunma, Japón (aprobación no. 19-001). Los ratones fueron criados en el Centro de Biorecursos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Gunma, Japón.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la inmunotransferencia: 1:1000 RAB35 (conejo; Cell Signaling, 9690 S), 1:10 000 Actina [C4] (ratón; Merck-Millipore, MAB1501), 1:10 000 GAPDH [6C5] (ratón; Merck-Millipore, MAB374), 1:1000 contactina-2/TAG-1 (cabra; sistemas de I+D, AF4439), 1:1000 CHL1 (cabra; sistemas de I+D, AF2147) y 1:1000 N-cadherina [32/N -cadherina] (conejo; BD, 610920). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la inmunotinción: 1:100 NeuN [A60] (ratón; Merck-Millipore, MAB377), 1:200 GFAP (conejo, Frontier Institute, GFAP-Rb-Af800), 1:200 β-galactosidasa ( ratón, Promega, Z3781), 1:100 Cux1 (conejo; Santa Cruz, sc13024), 1:100 Ctip2 (rata; Abcam, ab18465), 1:300 neurofilamento fosforilado [SMI-31] (ratón; Covance, SMI-31R ), 1:500 Tbr2 (conejo; Abcam, ab23345), 1:300 Pax6 (conejo; BioLegend, PRB-278P), 1:200 fosfo-Histona H3 (Ser10) [RR002] (conejo; Cell Signaling, 9701), y Nestin [Rat-401] 1:100 (ratón; Invitrogen, 14-5843-82). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios para la inmunotinción: cabra anti-rata Alexa Fluor-488, burro anti-ratón Alexa Fluor-488, burro anti-conejo Alexa Fluor-488, burro anti-ratón Alexa Fluor-594 y burro anti-conejo Alexa Fluor-594 (todos los anticuerpos son de Life Technologies).

Los cerebros frescos se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 2 %/solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 min a 2 h a 4 °C y se transfirieron secuencialmente a una serie de sacarosa al 5, 10 y 30 % en PBS durante la noche a 4 °C. C. Los cerebros se incrustaron en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek) y se crioseccionaron con un espesor de 30 μm. Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio y se lavaron con solución C (desoxicolato de sodio al 0,01%, NP-40 al 0,02%, EGTA 5 mM y MgCl2 2 mM en PBS) y se incubaron en solución D (X-gal 0,5 mg/ml, 10 mM K3[Fe(CN)6] y 10 mM K4[Fe(CN)6] en solución C) durante la noche a 37 °C. Después de la fijación con PFA/PBS al 4% durante 10 minutos, las secciones se sometieron a tinción roja nuclear resistente. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BX50 (Olympus).

A los ratones adultos se les perfundió transcardialmente PFA/PBS al 4% y los cerebros se fijaron posteriormente durante la noche a 4 °C. Para las secciones de parafina, los cerebros fijados se deshidrataron en etanol al 70%, se incluyeron en parafina y se seccionaron con un espesor de 4 μm. Las secciones se sometieron a recuperación de antígeno utilizando un autoclave en tampón citrato 0,01 M a 105 °C durante 15 min y se incubaron con H2O2/MeOH al 3% durante 30 min. Después de bloquear con BSA/PBS al 5 % durante 30 minutos, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-NeuN [A60] en BSA/PBS al 1 % a 4 °C durante la noche, seguido de la incubación con EnVision Plus System-HRP Labeled Polymer Anti-Mouse. kit (DAKO Cytomation, K4000) durante 1 h. La señal se visualizó utilizando el sistema cromógeno de sustrato Liquid DAB (DAKO Cytomation). Después de enjuagar con agua, las secciones se tiñeron con hematoxilina. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BZ-9000 (Keyence) o un BX50 (Olympus). Para la cuantificación del grosor cortical y el número de células NeuN positivas, se analizaron imágenes de corteza cerebral de 300 μm de ancho utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud). Para el análisis de contenedores del hipocampo, las imágenes de 200 μm de ancho × 500 μm de largo en CA1 y CA3 o 200 μm de ancho × 250 μm de largo en DG se dividieron en cinco contenedores iguales; luego, se contaron los números de células positivas para NeuN en cada contenedor utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud). Para las secciones congeladas, los cerebros aislados de embriones E15 y crías P0 y P6 se ​​fijaron en PFA al 4 %/PBS a 4 °C durante la noche, se deshidrataron en sacarosa al 30 %/PBS a 4 °C durante la noche, se incluyeron en el compuesto Tissue-Tek OCT. y crioseccionada. Las secciones de 10 μm de espesor se sometieron a recuperación de antígeno en tampón citrato 0,01 M (pH 6,0) a 90 °C durante 10 minutos (para tinción Cux1, Ctip2, Pax6 y Tbr2) o en Histo VT one (NACALAI TESQUE) a 70 °C 10 min (para tinción con pHH3), seguido de permeabilización con Triton X/PBS al 0,1% durante 10 min (tinción con Pax6 y Tbr2). Después de bloquear con BSA/PBS al 1% durante 10 minutos, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con BSA/PBS al 1% durante 10 minutos, seguido de incubación con anticuerpos secundarios y DAPI. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BZ-9000 (Keyence) o BX50 (Olympus). Las células positivas para Pax6, Tbr2 o pHH3 en CA de 250 μm de ancho o DG de 100 μm de ancho se analizaron utilizando el software ImageJ. Los análisis cuantitativos se realizaron ciegos al genotipo. Básicamente se analizaron dos secciones por animal. Para la tinción con β-galactosidasa, se lavaron secciones sagitales de 20 μm de espesor con PBS, se permeabilizaron y se bloquearon con Triton X-100 al 0,1%/NDS/PBS al 5% durante 20 minutos. las secciones se incubaron con anticuerpos anti-β-galactosidasa y anti-NeuN o GFAP en Triton X-100 al 0,1 %/NDS/PBS al 1 % a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios y DAPI durante 1 h. las imágenes fueron adquiridas utilizando FV1200 (Olympus).

Las secciones coronales (4 μm de espesor) en Bregma −0,35 mm colocadas en portaobjetos se empaparon secuencialmente en xileno (tres veces durante 5 min), etanol al 100% (tres veces durante 3 min) y etanol al 95% (5 min). Luego, las secciones se incubaron con Luxol Fast Blue al 0,1 %/etanol al 95 % a 50 °C durante la noche. Después de lavar con agua, las secciones se empaparon en carbonato de litio al 0,05% durante 5 s, se deshidrataron como se indicó anteriormente y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% (Sigma, C5042). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BZ-9000 (Keyence) y se analizaron utilizando el software ImageJ.

Brevemente, los cerebros incluidos en OCT se seccionaron en el plano coronal con un espesor de 50 μm y los cortes se transfirieron a placas de 24 pocillos en PBS. Las rodajas se enjuagaron exhaustivamente con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100/PBS al 0,1% durante 20 minutos. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron en Neurotrace 530/615 (1:200; Thermo Fisher Scientific; N21482) durante 60 minutos y se enjuagaron con PBS. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BZ-9000 (Keyence).

Se homogeneizaron cerebros de ratón aislados en tampón homogeneizado frío (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, sacarosa 0,32 M, EDTA 1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM con cóctel de inhibidor de proteasa) utilizando un homogeneizador Dounce. Después de la adición de una cantidad igual de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 % y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM con proteasa cóctel inhibidor), los lisados ​​se incubaron en hielo durante 30 min y se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 min a 4 °C. Los sobrenadantes se mezclaron con el tampón de muestra, se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear con leche desnatada al 5%/TBST (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,05%), las membranas se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios en leche desnatada al 1%/TBST. Las intensidades de las bandas inmunorreactivas se cuantificaron mediante ImageQuant TL (GE Healthcare).

Se diseccionaron hipocampos de embriones de ratón E18.5, se trataron con tripsina al 0,15% (Gibco) y colagenasa al 0,1% (Wako) a 30 °C durante 30 minutos y luego se trituraron suavemente. Para medir las longitudes de los axones y las neuritas, se sembraron 2 × 104 células (para longitudes de neuritas) o 6 × 104 células (para intensidad de contactina-2) en placas de 3,5 cm recubiertas de poli-l-lisina (para neuritas). longitudes) o cubreobjetos en placas de 3,5 cm (para intensidad de contactina-2) y cultivados en un medio neurobasal (Gibco, 21103049) suplementado con B27 al 2 % (Gibco, 17504001) y glutamina 0,5 mM (Sigma-Aldrich) para DIV 3 o DIV 2. Para medir la longitud de las neuritas, las células se fijaron con PFA/PBS al 4 % durante 30 min, se permeabilizaron con Triton-100/PBS al 0,1 % durante 15 min, se bloquearon con NDS/PBS al 5 % durante 1 h y se incubaron con un anti -anticuerpo de neurofilamento fosforilado [SMI-31] y faloidina conjugada con rodamina (Thermo Fisher Scientific, R415) durante la noche a 4 °C. Luego, las células se incubaron con un anticuerpo secundario y DAPI durante 1 h. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal FV1000 (Olympus). La longitud del axón (neuritas positivas para neurofilamentos fosforilados) y la longitud total de las neuritas (neuritas positivas para faloidina conjugada con rodamina) se midieron utilizando el software ImageJ. Para la tinción con contactina-2, las células se fijaron con PFA/PBS al 4% durante 15 minutos, se permeabilizaron con saponina/PBS al 0,05% durante 15 minutos, se bloquearon con NGS/PBS al 5% durante 1 h y se incubaron con un anti-contactina-2. anticuerpo y faloidina conjugada con rodamina durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las células se incubaron con un anticuerpo secundario y DAPI durante 1 h. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal FV1200 (Olympus). Para expresar GFP y GFP-RAB35 exógenas, se transfectaron 8 x 104 células con plásmidos pcDNA3.1 GFP o GFP-RAB35 en DIV 1 usando HilyMax (DOJINDO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se fijaron en DIV 3. Cuantificación de la intensidad de contactina-2 en la membrana plasmática somática se realizó utilizando el software ImageJ.

Se realizaron pruebas de comportamiento con los compañeros de camada machos de control (Rab35flox/+; Nestin-Cre) y Rab35 cKO (Rab35flox/flox; Nestin-Cre) a las 12-18 semanas de edad durante el período de luz del ciclo de luz/oscuridad de 12 h. . Los ratones fueron manipulados 5 minutos por día durante 4 a 5 días antes de una batería de pruebas de comportamiento y se habituaron a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes de cada prueba. Las pruebas de comportamiento fueron realizadas por un experimentador que desconocía el genotipo. En la prueba de campo abierto, cada ratón se colocó en una esquina del aparato de campo abierto, que consistía en PVC blanco (50 × 50 × 40 cm, ancho × profundidad × alto; O'Hara & Co.) y se iluminó a 70 lux. y se le permitió moverse libremente durante 15 min. Los datos se registraron y analizaron utilizando el software Time OFCR1 (O'Hara & Co.). El aparato de laberinto en cruz elevado (O'Hara & Co.) constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados (25 × 5,5 cm cada uno) con paredes transparentes de 15 cm de altura. El laberinto se colocó a 50 cm del suelo y se iluminó a 70 lux. Cada ratón se colocó en el centro del laberinto frente a un brazo abierto y se le permitió moverse libremente en el laberinto durante 10 minutos. Los datos se registraron y analizaron utilizando el software ImageJ EP1 (O'Hara & Co.). En la prueba de rotarod, los ratones se colocaron sobre una varilla (O'Hara & Co.) que giraba a 4 rpm. La velocidad de rotación se aceleró de 4 a 40 rpm durante un período de 300 s. Los ratones fueron entrenados en tres ensayos por día con un intervalo de 1,5 h entre ensayos durante dos días secuenciales. Se midió el tiempo en que un ratón caía de la varilla. El aparato de laberinto en cruz elevado (O'Hara & Co.) constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados (25 × 5,5 cm cada uno) con paredes transparentes de 15 cm de altura. El laberinto se colocó a 50 cm del suelo y se iluminó a 70 lux. Cada ratón se colocó en el centro del laberinto frente a un brazo abierto y se le permitió moverse libremente durante 10 minutos. Los datos se registraron y analizaron utilizando el software ImageJ EP1 (O'Hara & Co.). El aparato del laberinto en Y estaba compuesto por tres brazos opacos y se iluminaba a 70 lux. Cada ratón se colocó al final de un brazo y se le permitió moverse libremente durante una sesión de 8 minutos. El porcentaje de alternancias espontáneas se calculó de la siguiente manera:

Los datos se registraron y analizaron utilizando el software Time YM1 (O'Hara & Co.). El aparato de laberinto de Barnes (O'Hara & Co.) es una plataforma circular (1 m de diámetro) con 16 agujeros equiespaciados a lo largo del perímetro, elevada 75 cm sobre el suelo. Debajo de uno de los agujeros había una caja de escape negra que representaba el objetivo. El orificio objetivo (agujero de escape) fue consistente para cada ratón pero aleatorizado entre ratones. La iluminación se mantuvo a 200 lux. Se colgaron cuatro señales espaciales con distintos colores y formas de las paredes de la sala de pruebas durante la fase de entrenamiento y la prueba de sonda, pero no durante la fase de habituación. Durante la habituación (día 1), cada ratón se colocó en una cámara de inicio cilíndrica opaca en el centro del laberinto. Después de 10 s, se permitió al ratón explorar libremente el laberinto durante 3 minutos y luego se lo guió suavemente hasta la caja de escape. Durante las pruebas de adquisición (días 2 a 5), ​​10 s después de haber sido colocado en la cámara de inicio, a cada ratón se le permitió explorar libremente el laberinto durante 3 minutos por prueba. A cada ratón se le dieron tres pruebas con un intervalo de 15 minutos entre las pruebas durante cuatro días secuenciales. Las pruebas finalizaron cuando el ratón entró en el agujero objetivo o cuando habían transcurrido los 3 minutos. Los ratones que no entraron en la caja de escape fueron guiados suavemente hasta el orificio objetivo y pasaron 1 minuto. Durante la prueba de sonda (día 6), cada ratón exploró libremente el laberinto sin una caja de escape durante 3 minutos. Los datos se registraron y analizaron utilizando el software Time BCM (O'Hara & Co.). La prueba de sonda utilizó 90 s de datos de 3 min para el análisis.

A ratones preñados en E14.5 se les inyectaron por vía intraperitoneal 50 mg/kg de peso corporal de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU; Thermo Fisher Scientific, A10044). Los cerebros de los compañeros de camada P12 se aislaron y fijaron en PFA al 4 %/PBS a 4 °C durante la noche, se deshidrataron en sacarosa al 30 %/PBS a 4 °C durante la noche, se incluyeron en el compuesto OCT y se crioseccionaron con un espesor de 20 μm. La detección de EdU se realizó utilizando un protocolo del kit de imágenes Click-it EdU Alexa 594 (Thermo Fisher Scientific, C10339) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio BZ-9000 (Keyence). Para la cuantificación, el hipocampo (400 μm de ancho) y la corteza (500 μm de ancho) se dividieron en cinco o diez contenedores iguales y se cuantificó el número de células EdU positivas. Básicamente, se analizaron dos secciones por animal utilizando el software ImageJ.

Los hipocampos de los grupos de ratones control (Rab35flox/+; Nestin-Cre) y Rab35 cKO en P0 (n = 5 réplicas biológicas por genotipo) se lisaron en un tampón que contenía clorhidrato de guanidina 6 M, HEPES-NaOH 100 mM (pH 8,0). , TCEP 10 mM y cloroacetamida 40 mM. Los lisados ​​se disolvieron mediante calentamiento y sonicación, seguido de centrifugación a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Las proteínas (100 µg cada una) se purificaron usando precipitación con metanol/cloroformo y se solubilizaron mediante la adición de 20 µl de RapiGest SF al 0,1 % (Waters) en bicarbonato de trietilamonio 50 mM. Después de repetidas sonicaciones y agitación vorticial, las proteínas se digirieron con 1 µg de mezcla de tripsina/Lys-C (Promega) durante 16 h a 37 °C. Las concentraciones de péptidos se determinaron utilizando el ensayo colorimétrico cuantitativo de péptidos Pierce (Thermo Fisher Scientific). Se marcaron aproximadamente 25 µg de péptidos para cada muestra con 0,2 mg de reactivos TMT10-plex (Thermo Fisher Scientific) durante 1 h a 25 °C. Después de que la reacción se extinguió con hidroxilamina, todas las muestras marcadas con TMT se agruparon, se acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) y se fraccionaron utilizando el kit de fraccionamiento de péptidos de fase reversa de pH alto Pierce (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron nueve fracciones utilizando 5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25 y 80% de acetonitrilo (ACN). Cada fracción se evaporó en un concentrador SpeedVac y se disolvió en TFA al 0,1% y ACN al 3%.

El análisis LC-MS/MS de los péptidos resultantes (1 µg cada uno) se realizó en un UHPLC EASY-nLC 1200 conectado a un espectrómetro de masas Q Exactive Plus a través de una fuente de iones de nanoelectrospray (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos se separaron con un gradiente lineal de 4 a 20% de ACN durante los minutos 0 a 180 y de 20 a 32% de ACN durante los minutos 180 a 220, seguido de un aumento al 80% de ACN durante los minutos 220 a 230. El espectrómetro de masas se operó en un modo de adquisición dependiente de los datos con un método de 15 MS/MS superior. Los espectros de MS1 se midieron con una resolución de 70 000, un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 3 × 106 y un rango de masa de 375 a 1400 m/z. Los espectros HCD MS/MS se adquirieron con una resolución de 35.000, un objetivo AGC de 1 × 105, una ventana de aislamiento de 0,4 m/z, un tiempo de inyección máximo de 100 ms y una energía de colisión normalizada de 34. Se estableció la exclusión dinámica a 30 s. Los datos sin procesar se analizaron directamente con la base de datos SwissProt restringida a M. musculus utilizando Proteome Discoverer versión 2.3 (Thermo Fisher Scientific) con el motor de búsqueda Mascot versión 2.5 (Matrix Science) para la identificación y cuantificación de TMT. Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes: (a) tripsina como enzima con hasta dos escisiones omitidas; (b) tolerancia de masa de precursor de 10 ppm; (c) tolerancia de masa de fragmentos de 0,02 Da; (d) TMT de lisina y péptido N-terminal y carbamidometilación de cisteína como modificaciones fijas; y (e) oxidación de metionina como modificación variable. Los péptidos se filtraron a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1 % utilizando el nodo percolador.

Para cuantificar la contactina-2 y CHL1, se midieron al menos tres péptidos/proteínas utilizando PRM, un método de cuantificación dirigida basado en MS/MS que utiliza MS de alta resolución. Los escaneos MS/MS dirigidos se adquirieron mediante una lista de inclusión programada en el tiempo con una resolución de 70 000, un objetivo AGC de 2 × 105, una ventana de aislamiento de 4,0 m/z, un tiempo máximo de inyección de 500 ms y una energía de colisión normalizada. de 27. La alineación temporal y la cuantificación relativa de las transiciones se realizaron utilizando PinPoint versión 1.4 (Thermo Fisher Scientific).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 8 (software GraphPad) y el software EZR54. Los tamaños de las muestras se determinaron en base a estudios previos que utilizaron experimentos similares. Los experimentadores estuvieron cegados durante la adquisición de datos de imágenes, cuantificación y pruebas de comportamiento. Se verificó la normalidad de los datos, incluidos los delineadores, mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la igualdad de la varianza se verificó mediante la prueba F. Las medias entre los dos grupos se compararon mediante una prueba paramétrica (prueba t de Student no pareada de dos colas o prueba t de Welch) o una prueba no paramétrica (prueba U de Mann-Whitney de dos colas). Las medias entre los tres grupos se compararon mediante un ANOVA unidireccional. Los datos de múltiples grupos se analizaron mediante ANOVA de dos vías de medidas repetidas con pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. En los gráficos de puntos, las barras representan la media ± SEM. En los diagramas de caja y bigotes, los cuadros representan el rango intercuartil (percentil 25 al 75) y las barras en los cuadros representan la mediana. Los bigotes cubren el rango del mínimo al máximo. Los puntos en los gráficos muestran puntos de datos individuales. La información individual sobre el tamaño de la muestra y las pruebas estadísticas se describe en las leyendas de las figuras. La significación estadística se estableció en p < 0,05. Todos los experimentos, excepto el experimento de transferencia Western de cerebros E13.5 y el análisis proteómico, se realizaron al menos dos veces con resultados similares.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos mostrados en estos hallazgos están disponibles a través de los autores previa solicitud. Los datos proteómicos de este estudio se han depositado en jPOST. Los números de acceso son PXD041290 para ProteomeXchange y JPST002112 para jPOST. Las transferencias originales sin recortar y las imágenes de PCR se pueden encontrar en las figuras complementarias. 3, 4. Los datos de origen de los gráficos se pueden encontrar en Datos complementarios 2.

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Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Sato por su amable ayuda y útil discusión. También agradecemos a los Dres. Hideaki Miwa, Yuchio Yanagawa (Universidad de Gunma) y Akiko Hayashi-Takagi (RIKEN) por sus sugerencias sobre pruebas de comportamiento en ratones; Dr. Masatoshi Nomura (Universidad de Kurume) y Dres. Akihiro Harada y Masataka Kunii (Universidad de Osaka) por la generación de líneas de ratón knockout; y la Sra. Megumi Kawano (Universidad de Tokushima) por su soporte técnico para LC-MS/MS. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (números de subvención 16J11714, 19J40272 y 23K05678 a IM); y los Programas de Uso Conjunto e Investigación Conjunta del Instituto de Ciencias Médicas Avanzadas de la Universidad de Tokushima en KS. Este trabajo también fue apoyado por JSPS KAKENHI (17H03669, 19H05711 y 20H00466) y Takeda Science Foundation en KS.

Laboratorio de Tráfico Molecular, Instituto de Regulación Molecular y Celular, Universidad de Gunma, Maebashi, Gunma, 371-8512, Japón

Ikuko Maejima, Tomoko Akuzawa, Rika Hirai, Hisae Kobayashi, Inoya Isobe y Ken Sato

Laboratorio de Ciencias de la Alimentación y la Vida, Facultad de Ciencias Humanas, Universidad de Waseda, Tokorozawa, Saitama, 359-1192, Japón

Taichi Hara

Sección de Ciencias de los Animales de Laboratorio y del Genoma, Institutos Nacionales de Ciencia y Tecnología Cuántica y Radiológica, Chiba, Chiba, 263-8555, Japón

Satoshi Tsukamoto

Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japón

Hiroyuki Koizumi y Kazuo Emoto

Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Ohu, Koriyama, Fukushima, 963-8611, Japón

Hiroyuki Koizumi

Departamento de Respuestas Adaptativas y Desadaptativas en Salud y Enfermedades, Facultad de Medicina, Universidad de Kyoto, Kyoto, 606-8507, Japón

Takeshi Kawauchi

División de Señalización Celular, Instituto Conmemorativo Fujii de Ciencias Médicas, Universidad de Tokushima, Tokushima, Tokushima, 770-8503, Japón

Hidetaka Kosako

Iniciativa de la Universidad de Gunma para la Investigación Avanzada (GIAR), Universidad de Gunma, Maebashi, Gunma, 371-8512, Japón

Ken Sato

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KS, TH e IM diseñaron los experimentos. IM caracterizó las líneas de ratones knockout para Rab35. KE, TK y H. Koizumi supervisaron los experimentos de migración. TA y II realizaron los experimentos de inmunohistoquímica. RH e IM realizaron los experimentos utilizando neuronas primarias. TH, ST y H. Kobayashi generaron las líneas de ratón knockout. H. Kosako supervisó y realizó los experimentos de espectrometría de masas. KS y TH supervisaron el proyecto. IM y KS escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Ken Sato.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Biología de las Comunicaciones agradece a Christian González-Billault y Emilie Pacary por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Edwina McGlinn y George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Maejima, I., Hara, T., Tsukamoto, S. et al. RAB35 es necesario para el desarrollo y las funciones del hipocampo murino regulando la distribución de células neuronales. Común Biol 6, 440 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04826-x

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Recibido: 03 de septiembre de 2021

Aceptado: 07 de abril de 2023

Publicado: 21 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04826-x

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